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青光眼动物模型中自噬与视网膜神经节细胞的关系

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发表于 2019-1-4 10:08:47 | 显示全部楼层 |阅读模式
作者:天圣社区

青光眼的发病机制主要是视野的进行性缺损,而视野的缺损是由于视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)死亡引起的。

青光眼动物模型中自噬与视网膜神经节细胞的关系

傅诗雅 综述 张旭 审校

330006 南昌大学附属眼科医院 江西省眼科学与视觉科学研究所

江西省眼科学重点实验室

通信作者:张旭,Email:xuzhang19@163.com

DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2017.02.018

傅诗雅, 张旭. 青光眼动物模型中自噬与视网膜神经节细胞的关系[J]. 中华实验眼科杂志, 2017, 35(2):180-183.

【摘要】 青光眼的主要病理特征是视网膜神经节细胞(RGCs)渐进性丢失,而其损伤机制尚未明确。自噬是溶酶体降解物质的过程,该过程消除了受损的细胞成分,包括细胞器和长寿蛋白,这对维持细胞内环境的稳定有着重要作用。最近的研究表明,自噬参与了青光眼发病的病理生理过程。本文总结了视神经损害模型、视网膜缺血—再灌注模型、高眼压模型等不同青光眼动物模型中自噬与RGCs的关系,发现在不同青光眼动物模型中。自噬既可促进RGCs存活,又可促进其死亡,而在相同动物模型中,自噬对RGCs的调节也发挥着双刃剑的作用。同时阐述了自噬与具有神经元保护作用的Sirt1之间的相互作用。

【关键词】青光眼;动物模型;自噬;视网膜神经节细胞

基金项目:国家自然科学基金项目(81271425、81260148)

青光眼的发病机制主要是视野的进行性缺损,而视野的缺损是由于视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)死亡引起的[1]。目前的研究认为,应激是RGCs死亡的决定性因素,神经营养因子信号改变、兴奋性毒性、氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白质错误折叠和神经胶质细胞激活,缺氧、缺血、基因突变和自身免疫为共同因素参与RGCs死亡[2-5]。研究发现阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等中枢神经系统退行性疾病的病变机制与青光眼视RGCs的死亡机制有相似之处。自噬在AD和PD中的作用已被广泛报道。自噬在高眼压应激、视神经保护、视盘重塑、异常蛋白清除、免疫调节等方面的作用也逐渐受到重视[6]。自噬是参与了RGCs的死亡还是对其死亡有保护作用仍未有定论,本文将重点阐述在各型青光眼动物模型中自噬与RGCs的关系。

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自噬的定义

自噬是调控真核细胞内衰老长寿蛋白和细胞器的过程,在进化上高度保守且为真核细胞所特有[7]。自噬在几乎所有维持稳态的细胞中都保持在较低的基础水平。当细胞应对不同形式的压力时,如饥饿、生长因子缺乏、缺氧或蛋白质积累等,自噬被诱导,产生分解代谢,分解产物被释放到细胞质中,回收大分子成分并产生能量,以维持不利条件下细胞的存活[8]。即在生理状态下,自噬参与细胞的基本生理过程,但当细胞接受不同应激时自噬也可被诱导。自噬是一种细胞死亡的方式,而凋亡是另一种细胞程序性死亡的模式,它是由各种因素触发细胞内预存的死亡程序而导致细胞的主动死亡,其形态学特征为细胞皱缩、核染色质边集和凋亡小体形成,最终凋亡小体被巨噬细胞所吞噬。虽然自噬与凋亡在发生机制、形态学特点等方面具有显著差异,但二者在功能上联系密切,共同调控细胞的生存和死亡[9]。

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自噬的分类

根据底物与溶酶体结合方式的不同,自噬被分为巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬和RNA自噬。在哺乳动物中,前3种形式的自噬已被证实。RNA自噬是新发现的一种类型,称为“RNautophagy”。

微自噬是指细胞质中的蛋白质和细胞器直接通过溶酶体膜内陷的方式进入溶酶体后被降解[10]。分子伴侣介导的自噬是指蛋白与分子伴侣在细胞质内结合后被靶向运输至溶酶体膜,然后直接穿过膜进入溶酶体后被降解[11]。RNA自噬是指细胞质中的RNA与溶酶体膜相关蛋白LAMP2C结合后直接进入溶酶体被降解,此过程具有ATP依赖性[12]。巨自噬的形成,首先在吞噬泡装配现场将完整的细胞器(如线粒体)和部分的细胞质隔离成一个双层膜囊泡,称为吞噬泡;然后吞噬泡伸长、扩张、关闭,形成自噬体;随后,自噬体与溶酶体融合形成一个自噬溶酶体;最后底物与溶酶体水解酶结合,底物被水解后所得的大分子物质穿过膜回到细胞质中循环利用[13]。本文主要讨论巨自噬。

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自噬的分子调控

细胞所处环境的改变会影响自噬的信号通路,通路中涉及许多自噬相关基因(autophagy related gene, Atg)。Atg最初在酵母中被发现,随后的研究表明,在酵母和真核生物中有许多功能相对应的Atg,它们互为同源基因[14]。目前,自噬的调控大多是以哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyein, m-TOR)为中心而展开的。自噬通路中m-TOR下游得第一个组件是Atg1,Atg1可能在自噬起始阶形成吞噬泡装配现场时起重要作用。m-TOR被激活后磷酸化Atg,导致Atgl活性减低,抑制自噬发生;相反地,抑制m-TOR后Atgl激活,启动自噬发生[15]。雷帕霉素是m-TOR的抑制剂,可通过抑制m-TOR的活性而激活Atgl,诱导自噬[16]。在哺乳动物中,磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)的作用靶点是m-TOR,以此来调节自噬。PI3K途径是指生长因子或者胰岛素与细胞表面相应受体结合,激活PI3K,然后使磷酸酰肌醇2磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, PIP2)转换为PIP3,随后Akt向细胞膜聚集并磷酸化,最后激活m-TOR,抑制自噬发生[17]。此外,腺苷酸活化蛋白激酶可以感受能量代谢的变化,在饥饿时被激活,通过抑制m-TOR的活性而直接诱导自噬[18]。MAPK/ERK通路则通过抑制TSC1/2复合物来激活m-TOR[19]。缺氧也可以抑制m-TOR的活性[20]。Beclin 1是哺乳动物中与酵母Atg6同源的基因,它与辅助因子相互作用来调节脂质激酶VPS-34蛋白,并形成Beclin1-VPS34-VPS15核心复合体,从而诱导自噬。当Beclin 1裂解时自噬被抑制[21]。

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自噬的连接系统

吞噬泡形成后,吞噬泡膜的延长需要2个泛素样蛋白偶联系统。第1个是微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3, LC3)连接系统,存在于哺乳动物体内,与酵母中Atg8所编码的蛋白同源。proLC3是LC3未加工的前体,被Atg4切割后生成具有暴露甘氨酸的LC3-I。然而在自噬被诱导的过程中,LC3-I暴露的甘氨酸与Atg7、Atg3相连接,并通过多聚物Atg12-Atg5-Atg16与高亲脂性的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)结合,生成LC3-II[22]。LC3-II上的PE促使LC3-II连于吞噬泡和自噬体的脂质膜。有研究表明,LC3-II具有选择被降解物的作用,也有报道称在体外LC3-II可以促进膜牵引和融合。迄今为止,LC3-II是唯一可以特异性定位自噬结构的蛋白质,故LC3-II的检测被广泛用于测量细胞自噬的水平[23]。第2个是Atg5-Atgl2-Atgl6连接系统。在Atg7和Atg10的作用下,Atg12与裂解的Atg5结合生成Atg5-Atg12复合体,该复合体与Atg16结合后促进吞噬泡的成熟[24]。Atg5-Atg12的结合是诱导自噬的必要条件,但并不依赖于自噬的诱导,若Atg5-Atg12从自噬体上解离,则自噬被抑制[23]。

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各型青光眼动物模型中的自噬与RGCs

5.1 视神经损害模型

视神经损害模型造成视神经轴浆运输障碍,形成视神经原发性损伤和继发性变性,最终导致RGCs凋亡,模拟青光眼的发病过程。此模型包括视神经离断和视神经夹持2种,后者较前者更接近青光眼RGCs变性的病程。

5.1.1 视神经离断模型LC3主要表达在视网膜神经节细胞层(ganglion celllayer, GCL)和感光细胞层。Kim等[25]通过通过Western blot的方法来显示离体LC3-II的水平,结果显示大鼠视神经离断后1 d~1周LC3显著升高,并在第3天时达高峰,表明视神经损伤后RGCs中自噬可能被激活。

小鼠视神经离断后3~10 d,RGCs中自噬体显著增多,在第5天时RGCs的死亡数量达到50%。应用自噬激活剂雷帕霉素后,RGCs的存活率升高。Atg4B-/-小鼠的视网膜中LC3-II水平降低,P62水平升高,提示在视网膜中自噬的水平下降。将Atg4B-/-小鼠的视神经离断后存活的RGCs数量减少。以上结果显示外伤性损伤后自噬对RGCs具有保护作用[26]。

5.1.2 视神经夹持模型向大鼠玻璃体腔内注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)可显著延迟视神经夹持后RGCs轴突的变性,使其始于90 min,持续至360 min。应用钙通道阻滞剂后,LC3阳性的自噬体数量有所减少,并显著延迟了视神经夹持后轴突变性的急性阶段,说明自噬参与了损伤介导的RGCs轴突的变性[27]。应用雷帕霉素后RGCs存活率升高[26],而应用3-MA可保护受损RGCs的轴突[27],对于这2种相反的结果可从以下几个方面进行解释:首先,2个实验所研究的时间点不同,前者研究的是损伤后几天,而后者关注的是损伤后几个小时;其次,2个实验所选的动物模型虽然相似但并不相同,前者是视神经离断模型,后者是视神经夹持模型;再次,2个实验用于测量RGCs损伤的方法不同,前者用的是免疫组织化学法,而后者是在活体组织上进行观察。

5.2 视网膜缺血一再灌注模型

视网膜缺血—再灌注模型利用升高的眼压来降低视盘的血流灌注,最终导致RGCs进行性死亡,这是导致不可逆性视野缺损的共同条件。此模型模拟了青光眼病理改变中RGCs所经历的缺氧过程。

大鼠视网膜LC3-II的水平在短暂性缺血末期显著下降,在再灌注的早期阶段维持较低的水平。这可能是因为缺血-再灌注时机体所产生的能量不足以供给所有蛋白质合成和细胞激活的过程。缺血—再灌注24 h,视网膜缺血组的LC3-II水平与对照组相比并无明显差异[28]。另有研究表示,大鼠缺血—再灌注24 h,视网膜LC3-II水平有所升高。分析2个研究结果产生差异的原因,可能是LC3-II水平在早期下降,然后在缺血后约24 h回升到基础或更高的水平。应用3-MA可在一定程度上缓解缺血后RGCs数量的减少,并且3-MA可抑制凋亡,提示自噬和凋亡可以同时存在于缺血—再灌注损伤后的神经元[29]。在大鼠视网膜缺血损伤前向玻璃体腔内注射雷帕霉素,被诱导的自噬对视网膜缺血后的损伤并没有产生保护性作用[30]。大鼠视网膜缺血—再灌注损伤后,RGCs的细胞质中LC3表达增加,自噬体显著积聚,而RGCs的数目大量减少[31]。以上结果证明了自噬在缺血—再灌注损伤后RGCs死亡的发病机制中起到一定作用。

5.3 高压眼模型

灼烧2条或多条眼外静脉和激光光凝小梁网破坏房水排出,均可导致眼压升高。升高的眼压不仅可以直接造成RGCs的死亡,也可以破坏暂时存活的RGCs正常的轴突运输功能。除啮齿类动物以外,恒河猴因其适应性强、容易训养繁殖、生理上与人类较接近等优点也成为青光眼研究工作中比较理想的实验动物。

5.3.1 巩膜上静脉灼烧模型Park等[32]灼烧大鼠的巩膜静脉,眼压升高后1~2周视网膜内丛状层中自噬体水平增高,而在眼压升高后1~4周GCL中自噬体水平增高,LC3-II水平也同期增高,揭示了自噬的激活模式为早期在RGCs的树突,之后主要在RGCs的胞体;应用3-MA后可在一定程度上阻止RGCs的丢失。此研究证实随着眼压慢性升高自噬在受损的RGCs中顺序激活,并参与其死亡过程。

5.3.2 激光光凝模型 Deng等[33]用激光光凝恒河猴小梁网,眼压升高并长时间持续,期间LC3-II在GCL和内丛状层中累积,而长期(如40周)高眼压导致恒河猴的视盘凹陷,进行性的视盘凹陷是青光眼视神经损伤的特征性表现,该结果说明慢性青光眼发病过程中RGCs的损伤可能与自噬的激活有关。

Kitaoka等[34]用激光光凝大鼠小梁网,眼压升高后RGCs轴突数量减少,视神经中LC3-II和P62的水平升高;应用3-MA后加重了由高眼压引起的RGCs轴突的变性;而应用雷帕霉素则降低了高眼压对RGCs轴突的损害。此研究结果说明在高眼压的情况下,自噬对RGCs轴突的损伤有一定保护作用。

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自噬与Sirt1

Sirt1(silent mating type information regulation 2 homolog 1)属于去乙酰化酶家族的重要成员之一,除可调节细胞分化、代谢、衰老及凋亡外,还具有显著的神经元保护作用。Sirt1表达下调可能参与了青光眼的发病,而自噬与Sirt1之间存在一定联系,如Sirt1能与Atg5、Atg7和Atg8结合形成复合物并使其去乙酰化激活自噬;Sirt1激活剂白藜芦醇在Sirt1的参与下诱导自噬的激活,通过抑制S6激酶来抑制自噬;Sirt1抑制剂Sirtinol可促使自噬的水平升高;Sirt1通过调控自噬来帮助神经元抵抗由朊蛋白神经毒性导致的细胞死亡[35-39]。自噬也可调节Sirt1,多发性骨髓瘤细胞系在营养缺乏时激活的自噬可诱导Sirt1水平增高;应用3-MA可以抑制Sirt1的表达[39-40]。

7

小 结

综上所述,在不同类型的青光眼动物模型中自噬对RGCs既有保护作用又有促进其凋亡的作用,在某些相同类型的青光眼动物模型中,自噬对RGCs也可表现出双刃剑的作用。分析原因,首先考虑模型中自噬是否被诱导。研究中用LC3-II水平的升高来判断自噬被激活,但此时存在2种情况:一是自噬被诱导,LC3-II水平自然升高;二是自噬被破坏,原有的LC3-II被释放导致测得的水平升高。其次,被诱导的自噬会发挥怎样的作用。自噬激活后清除受损、异常的蛋白质和细胞器,产生游离氨基酸和脂肪酸并进一步加工以维持ATP的产生,从而利于细胞的存活。相反,过量或异常的自噬本身可能导致细胞的死亡[41]。对于青光眼发病过程中RGCs与自噬的关系还有待进一步研究。通过调控自噬来保护青光眼中RGCs免受损伤可能是青光眼视神经保护治疗的新靶点。

【参考文献 略】
zan



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